If you're seeing this message, it means we're having trouble loading external resources on our website.

Jeżeli jesteś za filtrem sieci web, prosimy, upewnij się, że domeny *.kastatic.org i *.kasandbox.org są odblokowane.

Główna zawartość

Sekwencjonowanie DNA

W jaki sposób określamy kolejność (sekwencje) nukleotydów (A, T, C i G) we fragmencie DNA. Tłumaczenie na język polski: fundacja Edukacja dla Przyszłości przy wsparciu Fundacji HASCO-LEK.

Kluczowe punkty:

  • Sekwencjonowanie DNA to proces określania sekwencji (kolejności) nukleotydów (A, T, C i G) we fragmencie DNA.
  • W przypadku sekwencjonowania Sangera docelowy DNA jest kopiowany wiele razy, w wyniku czego powstają fragmenty o różnej długości. Fluorescencyjne nukleotydy „terminujące” (kończące wzrost łańcucha) wyznakowują końce fragmentów i umożliwiają określenie sekwencji.
  • Techniki sekwencjonowania nowej generacji to nowe, zakrojone na szeroką skalę podejścia, które zwiększają szybkość i obniżają koszty sekwencjonowania DNA.

Czym jest sekwencjonowanie?

Być może słyszałeś o sekwencjonowaniu genomów. Na przykład ludzki genom ukończono sekwencjonować w 2003 r., po wieloletniej międzynarodowej współpracy. Ale co to znaczy sekwencjonować genom, czy nawet mały fragment DNA?
Sekwencjonowanie DNA to proces określania sekwencji (kolejności) zasad nukleotydowych (A, T, C i G) we fragmencie DNA. Dzisiaj, przy odpowiednim sprzęcie i materiałach, sekwencjonowanie krótkiego fragmentu DNA jest stosunkowo proste.
Sekwencjonowanie całego genomu (całego DNA organizmu) pozostaje skomplikowanym zadaniem. Wymaga podziału genomowego DNA na wiele mniejszych fragmentów, sekwencjonowania ich i złożenia sekwencji w jeden długi „konsensus”. Jednak dzięki nowym metodom, które zostały opracowane w ciągu ostatnich dwóch dekad, sekwencjonowanie genomu jest teraz znacznie szybsze i tańsze niż podczas projektu Human Genome 1.
W tym artykule przyjrzymy się metodom stosowanym do sekwencjonowania DNA. Skoncentrujemy się na jednej powszechnie uznanej metodzie, sekwencjonowaniu Sangera, ale omówimy również nowe metody („nowej generacji”), które zmniejszyły koszty i przyspieszyły sekwencjonowanie na dużą skalę.

Sekwencjonowanie Sangera: Metoda terminacji łańcucha

Regiony DNA o długości do około 900 par zasad są rutynowo sekwencjonowane przy użyciu metody o nazwie sekwencjonowanie Sangera lub metoda terminacji łańcucha. Sekwencjonowanie Sangera opracował brytyjski biochemik Fred Sanger i jego koledzy w 1977 roku.
W projekcie Human Genome zastosowano sekwencjonowanie Sangera do określenia sekwencji wielu stosunkowo małych fragmentów ludzkiego DNA. (Te fragmenty niekoniecznie musiały mierzyć 900 pb lub mniej, ale badacze byli w stanie „spacerować” wzdłuż każdego fragmentu za pomocą wielu rund sekwencjonowania Sangera.) Fragmenty zostały wyrównane w oparciu o zachodzące na siebie części w celu złożenia sekwencji większych regionów DNA i , ostatecznie całych chromosomów.
Chociaż obecnie genomy są zwykle sekwencjonowane przy użyciu innych metod, które są szybsze i tańsze, sekwencjonowanie Sangera jest nadal szeroko stosowane do sekwencjonowania poszczególnych fragmentów DNA, takich jak fragmenty stosowane w klonowaniu lub powstałe na drodze reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

Składniki do sekwencjonowania Sangera

Sekwencjonowanie Sangera polega na wykonaniu wielu kopii docelowego fragmentu DNA. Niezbędne do tego składniki są podobne do składników potrzebnych do replikacji DNA w organizmie lub do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), która kopiuje DNA in vitro. Te składniki to:
  • Enzym polimeraza DNA
  • Primer, który jest krótkim fragmentem pojedynczego DNA wiążącego się z DNA matrycowym i działającym jako „starter” polimerazy
  • Cztery nukleotydy DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
  • DNA matrycowe do sekwencjonowania
Jednakże reakcja sekwencjonowania Sangera zawiera również unikalny składnik:
  • Dideoksy, inaczej terminujące wersje wszystkich czterech nukleotydów (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), wyznakowane innymi barwnikami
_Źródło obrazu: "Whole-genome sequencing: Figure 1," autor OpenStax College, Biology (CC BY 4.0)._
Dideoksy nukleotydy są podobne do zwykłych nukleotydów, ale z jedną kluczową różnicą: brakuje im grupy hydroksylowej na 3' węglu pierścieni cukrowych. W zwykłym nukleotydzie grupa hydroksylowa 3 ' działa jak „haczyk”, umożliwiając dodanie nowego nukleotydu do istniejącego łańcucha.
Po dodaniu do łańcucha dideoksy nukleotydu, nie ma dostępnej grupy hydroksylowej i nie mogą być dodawane kolejne nukleotydy. Łańcuch kończy się dideoksy nukleotydem, który jest wyznakowany określonym barwnikiem w zależności od zasady (A, T, C lub G).

Metoda sekwencjonowania Sangera

Próbkę DNA, która ma zostać sekwencjonowana, miesza się w probówce ze starterem, polimerazą DNA i nukleotydami DNA (dATP, dTTP, dGTP i dCTP). Dodaje się także cztery wyznakowane barwnikiem, terminujące dideoksy nukleotydy, ale w znacznie mniejszych ilościach niż zwykłe nukleotydy.
Mieszaninę najpierw ogrzewa się w celu denaturacji matrycowego DNA (rozdzielenia nici), a następnie chłodzi, tak aby starter mógł związać się z jednoniciową matrycą. Po związaniu startera temperatura jest ponownie podnoszona, umożliwiając polimerazie DNA syntezę nowego DNA zaczynając od startera. Polimeraza DNA będzie kontynuować dodawanie nukleotydów do łańcucha, aż zdarzy jej się dodać dideoksy nukleotyd zamiast normalnego. W tym momencie nie jest już możliwe dodawanie żadnych nukleotydów, więc nić zakończy się dideoksy nukleotydem.
Proces ten powtarza się w kilku cyklach. Do czasu zakończenia cykli jest praktycznie gwarantowane, że dideoksy nukleotyd zostanie włączony w każdą pozycję docelowego DNA w co najmniej jednej reakcji. Oznacza to, że probówka będzie zawierać fragmenty o różnych długościach, kończące się w każdej pozycji nukleotydowej w oryginalnym DNA (patrz rysunek poniżej). Końce fragmentów zostaną wyznakowane barwnikami wskazującymi ich końcowy nukleotyd.
Obraz zmodyfikowane na podstawie "Sanger sequencing," autor Estevezj (CC BY-SA 3.0). Zmodyfikowany obraz podlega licencji (CC BY-SA 3.0).
Po zakończeniu reakcji fragmenty przepuszcza się przez długą, cienką rurkę zawierającą matrycę żelową w procesie zwanym kapilarną elektroforezą żelową. Krótkie fragmenty poruszają się szybko przez pory żelu, a długie fragmenty poruszają się wolniej. Gdy każdy fragment przecina „linię mety” na końcu rurki, jest oświetlany laserem, umożliwiając wykrycie dołączonego barwnika.
Najmniejszy fragment (kończący się tylko jednym nukleotydem za starterem) przecina linię mety jako pierwszy, a następnie kolejny najmniejszy fragment (kończący się dwoma nukleotydami za starterem) i tak dalej. Zatem na podstawie zarejestrowanych barwników w detektorze, sekwencja oryginalnego fragmentu DNA może być zbudowana jeden nukleotyd po drugim. Dane zarejestrowane przez detektor składają się z szeregu pików o danej intensywności fluorescencji, jak pokazano na chromatogramie powyżej. Sekwencja DNA jest odczytywana z pików na chromatogramie.

Zastosowania i ograniczenia

Sekwencjonowanie Sangera zapewnia sekwencjonowanie wysokiej jakości dla stosunkowo długich odcinków DNA (do około 900 par zasad). Zazwyczaj stosuje się je do sekwencjonowania poszczególnych fragmentów DNA, takich jak plazmidy bakteryjne lub DNA skopiowane w PCR.
Jednak sekwencjonowanie Sangera jest kosztowne i nieefektywne w przypadku projektów na większą skalę, takich jak sekwencjonowanie całego genomu lub metagenomu („genomu zbiorowego” populacji drobnoustrojów). W przypadku takich zadań nowe techniki sekwencjonowania na dużą skalę są szybsze i tańsze.

Sekwencjonowanie nowej generacji

Nazwa może brzmieć jak Star Trek, ale one tak naprawdę się nazywają! Najnowsze technologie sekwencjonowania DNA są nazywane sekwencjonowaniem nowej generacji.
Istnieje wiele technik sekwencjonowania nowej generacji, które wykorzystują różne technologie. Jednak większość łączy wspólny zestaw cech, które odróżniają je od sekwencjonowania Sangera:
  • Wysoce równoległe: wiele reakcji sekwencyjnych ma miejsce w tym samym czasie
  • Mikroskala: reakcje są prowadzone w małych objętościach i można ich prowadzić wiele jednocześnie na chipie.
  • Szybkie: ponieważ reakcje są wykonywane równolegle, wyniki są gotowe o wiele szybciej
  • Niski koszt: sekwencjonowanie genomu jest tańsze niż sekwencjonowanie Sangera
  • Krótsze długości: odczytują typowy zakres 50 -700 nukleotydów
Pod względem koncepcyjnym sekwencjonowanie nowej generacji przypomina trochę równoległą realizację bardzo dużej liczby niewielkich reakcji sekwencjonowania Sangera. Dzięki temu, że odbywa się to jednocześnie i w małej skali, metodami nowej generacji można sekwencjonować znacznie szybciej i taniej niż sekwencjonowaniem Sangera. Na przykład w 2001 r. koszt sekwencjonowania ludzkiego genomu wyniósł prawie 100 milionów dolarów. W 2015 roku byłoby to tylko 1245 dolarów2!
Dlaczego szybkie i tanie sekwencjonowanie ma znaczenie? Zdolność do rutynowego sekwencjonowania genomów otwiera nowe możliwości w badaniach biologicznych i zastosowaniach biomedycznych. Na przykład tanie sekwencjonowanie jest krokiem w kierunku spersonalizowanej medycyny - to znaczy leczenia dostosowanego do indywidualnych potrzeb, w oparciu o warianty genów w danym genomie.

Chcesz dołączyć do dyskusji?

Na razie brak głosów w dyskusji
Rozumiesz angielski? Kliknij tutaj, aby zobaczyć więcej dyskusji na angielskiej wersji strony Khan Academy.