Główna zawartość

Przegląd: Klonowanie DNA

Definicja, cel i podstawowe kroki klonowania DNA. Tłumaczenie na język polski: fundacja Edukacja dla Przyszłości, dzięki wsparciu wolontariuszy.

Kluczowe punkty:

Klonowanie DNA to technika biologi molekularnej, która pozwala na uzyskaniu wielu, identycznych kopii fragmentu DNA, na przykład genu.
W typowym klonowaniu, docelowy gen jest wklejany w kolistą cząsteczkę DNA zwaną plazmidem.
Plazmid jest wprowadzony do wnętrza bakterii w procesie zwanym transformacją, a bakterie niosące plazmid ulegają selekcji przy wykorzystaniu antybiotyków.
Wytypowany szczep bakteryjny może zostać użyty do produkcji: kolejnych kopii plazmidu lub białek.

Wprowadzenie

Kiedy słyszysz słowo "klonowanie" możesz pomyśleć o klonowaniu całego organizmu, tak jak było z owieczką Dolly. Jednak, słowo klonować znaczy tworzyć identyczną kopię pod względem genetycznym. W laboratoriach biologii molekularnej, klonowaniu często poddawane są geny lub inne niewielkie fragmenty DNA.

Jeśli twój zaprzyjaźniony biolog molekularny twierdzi, że „klonowanie” nie działa, prawie na pewno mówi o kopiowaniu fragmentów DNA, a nie o tworzeniu kolejnej Dolly!

Informacje ogólne o klonowaniu DNA

Klonowanie DNA to proces tworzenia wielu, identycznych kopii pewnego fragmentu DNA. Podczas typowej procedury, gen lub inny docelowy fragment DNA (być może gen kodujący ważne z medycznego punktu widzenia, białka dla człowieka) jest najpierw wklejany w kolistą cząsteczkę DNA zwaną plazmidem. Do tego używane są enzymy "kopiuj-wklej" DNA, które tworzą cząsteczkę zrekombinowanego DNA lub cząsteczkę zlepioną z kilku fragmentów pochodzących z różnych źródeł.

Następnie, zrekombinowany plazmid jest wprowadzany do komórki bakterii. Bakterie, które prawidłowo przyjęły plazmid są typowane i hodowane do dalszych celów. Rozmnażając się, przekazują plazmid komórkom potomnym, produkując wiele kopii swojego materiału genetycznego.

Jaki jest sens tworzenia tylu kopii plazmidu? W niektórych przypadkach, potrzeba wielu kopii DNA do przeprowadzania eksperymentu lub tworzenia całkiem nowych plazmidów. W innej sytuacji, fragment DNA może kodować użyteczne białko a cała komórka bakterii zostanie użyta do jego produkcji. Na przykład, po wprowadzeniu odpowiedniego genu do bakterii E. coli zacznie ona produkować insulinę, którą używają cukrzycy.

Jeżeli znasz kogoś z cukrzycą, być może wiesz o tym, że hormon insulina odgrywa bardzo ważną rolę w ludzkim organizmie. W ciele zdrowego człowieka jest ona wytwarzana w trzustce. Potem zostaje transportowana przez układ krwionośny i wiąże się z komórkami organizmu, pozwalając im wchłaniać cukier - glukozę.

U osób z cukrzycą typu I komórki trzustki, które odpowiedzialne są za produkcję i wydzielanie insuliny są uszkodzone. Dlatego takie osoby muszą regularnie doprowadzać insulinę do swoich organizmów z innych źródeł, aby zapobiec niebezpiecznie wysokiemu stężeniu glukozy we krwi (insulina pozwala na transport glukozy z krwi do komórek).

Przez wiele lat, insulina używana przez osoby z cukrzycą typu I pochodziła z trzustek świń i krów, które zostały ubite na mięso. Cząsteczka insuliny jest podobna u ludzi, świń i krów w takim stopniu, że insulina pobierana od tych zwierząt może zastąpić ludzką insulinę.

Począwszy od 1980 roku, naukowcy starają się opracować nowe metody otrzymywania ludzkiej insuliny wykorzystując do tego szczep bakterii Escherichia coli (E. coli). Zasadniczo to przekształcili komórki bakterii w malutkie fabryki produkujące insulinę. Taka zrekombinowana insulina, lub insulina wyprodukowana przez połączenie DNA z różnych źródeł (ludzkie i bakteryjne DNA) jest obecnie głównym elementem leczenia dla osób z cukrzycą typu I.

Klonowanie DNA krok po kroku

Klonowanie DNA jest używane do wielu celów. Jako przykład, za cel przyjmiemy syntezę białek (na przykład ludzkiej insuliny) za pomocą komórek bakterii. Podstawowymi krokami są:

Rozcięcie plazmidu i "wklejenie" do niego genu. Ten proces opiera się na użyciu enzymów restrykcyjnych (które rozcinają nici DNA) i ligazie DNA (która łączy nici DNA).
Wprowadzenie plazmidu do komórki bakterii. Użycie typowania antybiotykowego w celu zidentyfikowania szczepu, który przyjął plazmid.
Hodowla do dużych ilości komórki bakterii i użycie ich jako "fabryk" do produkcji białek. Zebranie zawiesiny białek z bakterii i oczyszczenie jej.

Przyjrzyjmy się dokładniej każdemu z tych kroków.

1. Rozcinanie i wklejanie DNA

Jak kawałki DNA z różnych źródeł mogą być ze sobą łączone? Większość metod opiera swoje działanie na dwóch grupach enzymów: enzymy restrykcyjne i ligaza DNA.

Enzymy restrykcyjne to enzymy rozcinające nici DNA, które rozpoznają docelową sekwencje zasad i w jego pobliżu rozcinają nici DNA. Wiele enzymów restrykcyjnych tworzą krótkie, jednoniciowe fragmenty DNA. Jeżeli dwie cząsteczki DNA zakończone są komplementarnymi zasadami, mogą tworzyć pary i łączyć się ze sobą. Jednakże, nie połączą się one bez udziału ligazy DNA, która wypełnia brakujące luki pomiędzy dwoma fragmentami.

Naszym celem jest wstawienie docelowego genu (np. gen kodujący ludzką insulinę) do plazmidu. Używając starannie dobranych enzymów restrykcyjnych, możemy uzyskać:

Rozcięty plazmid, gotowy do połączenia się z genem.
Docelowy fragment DNA (gen), którego końce są komplementarne do plazmidu.

Wtedy, możemy połączyć oba miejsca za pomocą ligazy DNA, która w ten sposób tworzy zrekombinowany plazmid posiadający docelowy gen.

2. Transformacja i typowanie szczepów bakteryjnych

Plazmidy i inne struktury DNA mogą być wprowadzanie do komórek bakteryjnych, na przykład do nieszkodliwych szczepów E. coli powszechnie używanych w laboratorium, w procesie zwanym transformacją. Podczas transformacji, odpowiednio przygotowane bakterie zostają wystawione na szok cieplny (wysoka temperatura), co podnosi prawdopodobieństwo, że przyjmą materiał DNA z otoczenia.

Typowy plazmid zawiera geny warunkujące antybiotykooporność, dzięki czemu pozwalają przetrwać bakterii w pobliżu specyficznego antybiotyku. W związku z tym bakterie, które pobrały plazmid z otoczenia możemy typować na płytkach odżywczych z dodatkiem antybiotyku. Bakterie bez plazmidu zginą, podczas gdy bakterie posiadające plazmid będą żyły i namnażały się. Każda komórka bakteryjna, która przetrwała, da wzrost w postaci małej, okrągłej kolonii stworzonej z identycznych komórek jak macierzysta, tak więc będą posiadały identyczny materiał genetyczny (w tym plazmid).

Nie wszystkie kolonie będą posiadały plazmid o prawidłowej strukturze. Dzieje się tak, ponieważ podczas ligacji fragmenty DNA nie zawsze zostają połączone z plazmidem w dokładnie takiej formie jakiej chcielibyśmy. Dlatego po wyhodowaniu kolonii należy pobrać od kilku z nich plazmidy i je sprawdzić. W tym celu powszechnie wykorzystywane są enzymy restrykcyjne i PCR.

3. Produkcja białek

Kiedy już znaleźliśmy kolonię bakterii z prawidłowym plazmidem, możemy hodować ją do większych kultur bakteryjnych. Potem, za pomocą bodźca chemicznego dajemy im sygnał aby zaczęły produkować docelowe białko.

Bakterie służą jako miniaturowe "fabryki", produkując duże ilości białek. Na przykład, jeżeli plazmid zawiera geny kodujące ludzką insulinę, bakteria w procesie transkrypcji przepisze ten gen na mRNA i użyje jej do produkcji ludzkiej insuliny.

Ludzie i bakterie posiadają ten sam kod genetyczny, co oznacza, że geny ludzkie mogą być przepisane i przetłumaczone na geny bakteryjne.

Jakkolwiek, aby ludzki gen uległ ekspresji w komórce bakteryjnej, musi przejść pewne modyfikacje. Szczególnie, że geny należy z niego usunąć introny. Introny są sekwencjami dzielącymi kodujące fragmenty DNA i są usuwane z eukariotycznego RNA poprzez splicingaby stworzyć mRNA. Bakterie nie posiadają intronów, dlatego należy je uprzednio usunąć.

Jak uzyskać wersję ludzkiego genu z usuniętymi intronami? Wersję bez intronów ludzkiego genu można wytworzyć z mRNA, który koduje gen, używając enzymu odwrotnej transkryptazy. Odwrotna transkryptaza syntetyzuje nić DNA przy użyciu nici mRNA jako matrycy. Po dodatkowym etapie, powstanie wersja genu bez intronów (zwana cDNA).

Gdy komórki bakteryjne wyprodukują już odpowiednią ilość białka, rozcina się je i uwalnia zawiesinę z ich wnętrza. Znajduje się w niej wiele więcej białek i makrocząsteczek oprócz białka docelowego (np. insuliny). Dlatego substancja pochodząca z bakterii musi zostać oczyszczona lub rozdzielona na białko docelowe i resztę cząsteczek innymi technikami biochemicznymi. Oczyszczone białka mogą zostać użyte do eksperymentów naukowych, lub tak jak w przypadku insuliny, jako lek.

Tak i nie. Zrekombinowana insulina produkowana przez koncerny farmaceutyczne jest w rzeczywistości produkowana przez bakterie, a geny kodujące jej produkcje pochodzą ze zmodyfikowanych genów ludzkiej insuliny. Insulina wyprodukowana przez bakterie jest oczyszczana w specjalnych kolumnach.

Jakkolwiek, produkcja aktywnej biologicznie insuliny wymaga pewnych dodatkowych kroków. Insulina zostaje produkowana pod postacią pojedynczych łańcuchów polipeptydowych. Jednakże, mostki disiarczkowe muszą powstawać wewnątrz łańcucha, a pewna jego część musi zostać przecięta na dwa rozdzielone łańcuchy (które wciąż będą utrzymywane razem tylko za pomocą tych wiązań). Tylko wtedy insulina będzie aktywna biologicznie, co oznacza, że będzie zdolna zachowywać się jak ludzki hormon.

Produkcja insuliny, nadającej się do użycia przez ludzi chorujących na cukrzycę również wymaga pewnych dodatkowych kroków w procesie oczyszczania, tak aby posiadała ona prawidłową formę.

Zastosowanie klonowania DNA

Cząsteczki DNA tworzone w procesie klonowania są używane na wiele sposobów. Krótka lista przykładów zawiera:

Biofarmacja. Klonowanie DNA może zostać zostać wykorzystane aby produkować ludzkie białka, takie jak wspomniana wyżej insulina. inne przykłady rekombinacji białek dotyczą ludzkiego hormonu wzrostu, który jest podawany pacjentom cierpiącym jego niedobry. Zrekombinowane białka są często produkowane w komórkach bakteryjnych.
Terapia genowa. W niektórych chorobach genetycznych, pacjentom brakuje funkcjonalnych fragmentów DNA. Na drodze terapii genowej możemy próbować dostarczyć brakującego fragmentu DNA do komórek ich ciała. Na przykład, klonowanie DNA było już wykorzystywane do dostarczenia prawidłowych wersji genów pacjentom z mukowiscydozą. Kiedy plazmidy zawierające gen dostarczały go do płuc, ich funkcjonalność wolniej się pogarszała $^{2}$ ‍.
Analiza genowa. W laboratoriach badawczych, naukowcy często używają klonowania DNA do produkcji sztucznych, zrekombinowanych wersji genów, które pomagają im zrozumieć jak normalne geny funkcjonują w organizmie.
Na przykład, naukowcy zajmujący się neuronami u muszek owocówek mogą używać klonowania DNA by uzyskać informacje o budowie neutralnego genu. Dzięki wiedzy o jego budowie, regiony regulujące (promotory) genu mogą zostać przeniesione tak aby kodowały fluorescencyjne białka. Jeżeli zastosowalibyśmy ten proces w żywej muszce owocówce, gen zostałby ujawniony w neuronach i spowodowałby, że świeciłyby one (wykazywały fluorescencję) pod wpływem światła UV.

To tylko kilka przykładów praktycznego wykorzystania klonowania DNA w dzisiejszej nauce. Jest to dość powszechna metoda używana w różnorodnych dziedzinach biologii molekularnej.

Szukaj wiadomości poza Khan Academy

Do you want to learn more about restriction enzymes? Check out this scrollable interactive and this simulation from LabXchange.

Do you want to learn more about the role of DNA ligase in gene cloning? Check out this scrollable interactive and this simulation from LabXchange.

Do you want to learn more about bacterial transformation? Check out this simulation from LabXchange.

Do you want to learn more about the selection of transformed bacteria? Check out this simulation from LabXchange.

LabXchange to bezpłatna platforma edukacyjna online stworzona przez Wydziale Arts and Sciences uniwersytetu Harvarda i wspierana przez Fundację Amgen.

Zmodyfikowany artykuł może być używany zgodnie z licencją CC BY-NC-SA 4.0.

Cytowane prace:

Superbest. (2014, 11 czerwiec). Jak działa szok cieplny? Z Biology stack exchange. Źródło: http://biology.stackexchange.com/questions/19038/how-does-heat-shock-transformation-work.
Alton, E. W. F. W., Armstrong, D. K., Ashby, D., Bayfield, K. J., Bilton, Diana, Bloomfield, E. V., ... Wolstenholme-Hogg, P. (2015). Powtarzalna nebulizacja niewirusowej terapii genowej pacjentów z mukowiscydozą: Losowa, powójnie ślepa próba z kontrolą placebo, faza 2b próbna. Lancet Respiratory Medicine, 3(9), 684-691. http://dx.doi.org/10.1016/S2213-2600(15)00245-3.

Dodatkowe źródła

Affibody. (n.d.). Insulina wyizolowana z ludzkiej surowicy. Źródło: http://affibody.com/upload/Research%20Reagents/Application%20notes/Insulin%20AFF%20application%20note%202007-03-30.pdf.

Amgen Biotech Experience. (2015). Podręcznik studencki. Źródło: https://www.amgenbiotechexperience.com/sites/abe.edc.org/files/abe_english_student_all_sequences_05.15.15.pdf.

Biotechnologia. (2016, 23 Marzec). Pobrane 29 marca, 2016 z Wikipedii: https://en.wikipedia.org/wiki/Biotechnology .

Gebel, E. (2013). Produkcja insuliny: zza kulisowe spojrzenie na produkcję leków ratujących życie. W Diabetes forecast. Źródło http://www.diabetesforecast.org/2013/jul/making-insulin.html?referrer=https :// www.google.com/.

Przełom terapii genowej mukowiscydozy. (2015, 3 lipca). NHS choices. Źródło http://www.nhs.uk/news/2015/07July/Pages/Gene-therapy-breakthrough-for-cystic-fibrosis.aspx.

R&D Systems. (2016). Zrekombinowane białka hormonu wzrostu (GH). Z Hormony wzrostu. Źródło https://www.rndsystems.com/products/recombinant-human-growth-hormone-gh-protein_1067-gh.

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). Bakterie i archeony. Campbell biology (edycja 10, strony 575-585). San Francisco, CA: Pearson.

Wilkin, D. (2016, March 23). Klonowanie genów - poziom zaawansowany z CK-12 biology advanced concepts. Źródło: http://www.ck12.org/book/CK-12-Biology-Advanced-Concepts/section/9.2/.

Chcesz dołączyć do dyskusji?

Zaloguj się

Sortuj według

Na razie brak głosów w dyskusji

Rozumiesz angielski? Kliknij tutaj, aby zobaczyć więcej dyskusji na angielskiej wersji strony Khan Academy.

Biologia - program rozszerzony

Kurs: Biologia - program rozszerzony > Rozdział 6