Główna zawartość

Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR)

Technika wykorzystywana do amplifikacji, czyli wytworzenia wielu kopii określonego docelowego regionu DNA. Tłumaczenie na język polski: fundacja Edukacja dla Przyszłości dzięki wsparciu Fundacji HASCO-LEK

Kluczowe punkty:

Reakcja łańcuchowa polimerazy w skrócie PCR to technika mająca na celu wykonanie wielu kopii określonego regionu DNA in vitro (w probówce, a nie w organizmie).
PCR opiera się na termostabilnej polimerazie DNA polimerazie Taq i wymaga do działania starterów DNA zaprojektowanych specjalnie dla interesującego regionu DNA.
W PCR reakcja jest cyklicznie powtarzana, a towarzyszy temu szereg zmian temperatury, co pozwala na wytworzenie wielu kopii regionu docelowego.
PCR jest wykorzystywany w badaniach naukowych, jak i ma wiele praktycznych zastosowań. Jest rutynowo stosowany w klonowaniu DNA, diagnostyce medycznej i analizie sądowej DNA.

Co to jest PCR?

Reakcja łańcuchowa polimerazy ( PCR ) jest powszechną techniką laboratoryjną stosowaną do tworzenia wielu kopii (milionów lub miliardów!) określonego regionu DNA. Ten region DNA może być wszystkim, czym interesuje się eksperymentator. Na przykład może to być gen, którego funkcję naukowiec chce zrozumieć, lub marker genetyczny wykorzystywany przez naukowców z laboratorium kryminalistycznego do dopasowania DNA z miejsca zbrodni do podejrzanych.

Zazwyczaj celem PCR jest wytworzenie wystarczającej ilości docelowego fragmentu DNA, aby można go było przeanalizować lub wykorzystać w inny sposób. Na przykład DNA zamplifikowany na drodze PCR może zostać przesłany do sekwencjonowania, analizowany za pomocą elektroforezy żelowej lub użyty do klonowania po uprzednim włączeniu go do plazmidu i do dalszych eksperymentów.

PCR jest stosowany w wielu dziedzinach biologii i medycyny, w tym w badaniach biologii molekularnej, diagnostyce medycznej, a nawet w niektórych gałęziach ekologii.

Polimeraza Taq

Podobnie jak replikacja DNA w organizmie, PCR wymaga obecności enzymu - polimerazy DNA, która tworzy nowe nici DNA, wykorzystując istniejące nici jako szablony. Polimeraza DNA zazwyczaj stosowana w PCR nazywa się polimerazą Taq , po bakterii odpornej na wysokie temperatury, z której została wyizolowana ( T hermus aq uaticus).

T. aquaticus żyje w gorących źródłach i kominach hydrotermalnych. Jego polimeraza DNA jest bardzo stabilna w wysokich temperaturach i najbardziej aktywna w okolicach

70 ° C

(temperatura, w której ludzka lub E. coli polimeraza DNA byłaby niefunkcjonalna). Ta stabilność termiczna czyni polimerazę Taq idealną do PCR. Jak zobaczymy, wysoka temperatura jest używana wielokrotnie w PCR do denaturacji matrycy DNA czyli rozdzielenia jej nici.

Startery PCR

Podobnie jak inne polimerazy DNA, polimeraza Taq może wytwarzać DNA tylko wtedy, gdy obecny będzie starter , czyli krótka sekwencja nukleotydów, która stanowi punkt wyjścia do syntezy DNA. W reakcji PCR eksperymentator określa region DNA, który zostanie skopiowany (amplifikowany) poprzez wybrane przez siebie startery.

Startery do PCR to krótkie fragmenty jednoniciowego DNA, zwykle o długości około

20

nukleotydów. W każdej reakcji PCR stosuje się dwa startery i są one zaprojektowane tak, aby otaczały fragment docelowy (fragment, który należy skopiować). Oznacza to, że mają sekwencje, które będą się wiązać z przeciwnymi niciami matrycy DNA, tylko na krawędziach fragmentu, który ma zostać skopiowany. Startery wiążą się z matrycą DNA przez komplementarne parowanie zasad.

Gdy startery są związane z matrycą, mogą zostać przedłużone przez polimerazę, a fragment leżący między nimi zostanie skopiowany.

Etapy PCR

Kluczowymi składowymi reakcji PCR są polimeraza Taq, startery, matrycowe DNA i nukleotydy (bloki budulcowe DNA). Składniki są umieszczane w probówce wraz z kofaktorami wymaganymi przez enzym i poddawane powtarzanym cyklom ogrzewania i chłodzenia, które umożliwiają syntezę DNA.

Podstawowymi etapami są:

Denaturacja ( $96 ° C$ ‍): Intensywne podgrzanie reakcji, aby rozdzielić, czyli zdenaturować nici DNA. W efekcie otrzymujemy jednoniciowy szablon dla następnego kroku.
Przyłączanie ( $55$ ‍ $-$ ‍ $65$ ‍ $° C$ ‍): Ochłodzenie reakcji, aby startery mogły związać się z komplementarnymi sekwencjami na jednoniciowym matrycowym DNA.
Wydłużanie (elongacja) ( $72 ° C$ ‍): Podniesienie temperatury reakcji, aby polimeraza Taq wydłużała startery, syntezując nowe nici DNA.

W typowej reakcji PCR cykl ten powtarza się

25

-

35

razy, co zwykle zajmuje

2

-

4

godziny, w zależności od długości kopiowanego fragmentu DNA. Jeśli reakcja jest efektywna (działa dobrze), liczba fragmentów docelowych może zwiększyć się z jednej lub kilku kopii do miliardów.

To dlatego, że nie tylko oryginalne DNA jest używane za każdym razem jako szablon. Nowe DNA powstałe w jednym cyklu może służyć jako szablon w następnym cyklu syntezy DNA. Jest wiele kopii starterów i wiele cząsteczek polimerazy Taq biorących udział w reakcji, więc liczba cząsteczek DNA może z grubsza podwoić się w każdym cyklu. Ten wzorzec wzrostu wykładniczego przedstawiono na poniższym obrazie.

Wykorzystanie elektroforezy żelowej do wizualizacji wyników PCR

Wyniki reakcji PCR są zazwyczaj wizualizowane (i analizowane) przy użyciu elektroforezy żelowej. Elektroforeza żelowa to technika, w której fragmenty DNA migrują przez matrycę żelową pod wpływem prądu elektrycznego i są rozdzielane według wielkości. Zazwyczaj dołącza się standard lub drabinkę DNA, aby można było określić wielkość fragmentów w próbce PCR.

Fragmenty DNA o tej samej długości tworzą „prążek” na żelu, który można zobaczyć gołym okiem, jeśli żel zostanie wybarwiony barwnikiem wiążącym DNA. Na przykład rezultat reakcji PCR, w wyniku której powstaje fragment o długości

400

par zasad (bp), wyglądałby tak na żelu:

Prążek DNA zawiera wiele, wiele kopii docelowego fragmentu DNA, a nie tylko jedną lub kilka kopii. Ponieważ DNA jest mikroskopijne, musi być obecnych wiele jego kopii, zanim będziemy mogli je zobaczyć na własne oczy. Jest to jeden z powodów, dlaczego PCR jest ważnym narzędziem: produkuje wystarczającą liczbę kopii sekwencji DNA, tak, że możemy je zobaczyć lub manipulować tymi fragmentami DNA.

Zastosowania PCR

Za pomocą PCR, daną sekwencję DNA można amplifikować miliony lub miliardy razy, wytwarzając wystarczającą liczbę kopii DNA do analizy przy użyciu innych technik. Na przykład DNA można wizualizować za pomocą elektroforezy żelowej, przesłać do sekwencjonowania lub trawić enzymami restrykcyjnymi i używać do klonowania z wykorzystaniem plazmidów.

PCR jest stosowany w wielu laboratoriach badawczych, a także ma praktyczne zastosowania w kryminalistyce, testach genetycznych i diagnostyce. Na przykład PCR stosuje się do amplifikacji genów związanych z zaburzeniami genetycznymi z DNA pacjentów (lub z DNA płodu, w przypadku badań prenatalnych). PCR można również wykorzystać do badania DNA bakterii lub wirusa w ciele pacjenta: jeśli patogen jest obecny, możliwe jest powielenie fragmentów jego DNA z próbki krwi lub tkanki.

Problem z próbką: PCR w kryminalistyce

Załóżmy, że pracujesz w laboratorium kryminalistycznym. Właśnie otrzymałeś próbkę DNA z włosów pozostawionych na miejscu zbrodni, a także próbki DNA od trzech potencjalnych podejrzanych. Twoim zadaniem jest zbadanie określonego markera genetycznego i sprawdzenie, czy którykolwiek z trzech podejrzanych pasuje do markera z DNA włosa.

Marker występuje w dwóch allelach (wersjach). Jeden zawiera pojedyncze powtórzenie (brązowy obszar poniżej), a drugi zawiera dwie kopie powtórzenia. W reakcji PCR ze starterami, które otaczają fragment kopiowany, w przypadku pierwszego allelu wytwarzany jest fragment DNA o długości

200

bp

, a w przypadku drugiego allelu wytwarzany jest fragment DNA o długości

300

bp

Wykonujesz PCR na czterech próbkach DNA i wizualizujesz wyniki za pomocą elektroforezy żelowej, jak przedstawiono poniżej:

Który DNA podejrzanego pasuje do DNA ze miejsca przestępstwa?

Ludzie są diploidami, co oznacza, że mają dwie kopie większości swojego DNA. Tak więc będą dwie kopie markera, który badamy w każdej próbce DNA.

Jeśli dana osoba ma dwa różne allele markera (jest heterozygotą), dwa różne prążki (

200

bp i

300

bp) zostaną zamplifikowane podczas PCR. Będą one widoczne jako prążki DNA w żelu w na wysokości prążków wzorca o długości

200

bp i

300

bp.

Jeżeli dana osoba ma dwie kopie tego samego allelu (homozygota), tylko jeden prążek zostanie zamplifikowany podczas PCR. Jeśli osoba jest homozygotyczna dla allelu

200

bp, tylko prążek

200

bp będzie widoczny na żelu. Podobnie, jeśli osoba jest homozygotyczna dla allelu

300

bp, na żelu będzie widoczny tylko prążek

300

bp.

Genotypy markerowe próbek DNA to:

DNA z miejsca zbrodni: homozygota, allel $200$ ‍ bp
Podejrzany $1$ ‍: homozygota, allel $300$ ‍ bp
Podejrzany $2$ ‍: heterozygota
Podejrzany $3$ ‍ homozygota, allel $200$ ‍ bp

Zarówno próbka DNA z miejsca przestępstwa, jak i próbka DNA od podejrzanego

3

są homozygotyczne dla wersji markera o długości

200

bp. Oznacza to, że dwie próbki są zgodne z tym markerem.

Więcej o PCR i kryminalistyce

W prawdziwych kryminalistycznych testach DNA z miejsca zbrodni technicy przeprowadziliby analizę koncepcyjnie podobną do tej z powyższego przykładu. Jednak zostałoby porównanych wiele różnych markerów (nie tylko pojedynczy marker, jak w tym przykładzie) między DNA z miejsca zbrodni a DNA podejrzanych.

Ponadto markery stosowane w typowej analizie kryminalistycznej nie występują tylko w dwóch różnych formach. Są wysoce polimorficzne (poly = wiele, morf = forma). Oznacza to, że występują w wielu allelach, które różnią się małymi przyrostami długości.

Najczęściej stosowany typ markerów w medycynie sądowej, zwany krótkimi powtórzeniami tandemowymi ( STR ), składa się z wielu powtarzających się kopii tej samej krótkiej sekwencji nukleotydowej (zazwyczaj o długości od

2

5

nukleotydów). Jeden allel STR może mieć

20

powtórzeń, podczas gdy inny może mieć

18

, a kolejny tylko

10

^{1}

Badając wiele markerów, z których każdy występuje w wielu formach alleli, naukowcy mogą zbudować unikalny genetyczny „odcisk palca” z próbki DNA. W typowej analizie STR przy użyciu

13

markerów, prawdopodobieństwo fałszywie dodatniego wyniku (dwie osoby posiadające ten sam „odcisk palca” DNA) jest mniejsze niż

1

10

miliard

^{1}

Chociaż możemy myśleć, że dowody DNA są wykorzystywane głownie do skazywania przestępców, odegrały one także kluczową rolę w uniewinnianiu fałszywie oskarżonych osób (w tym niektórych, którzy byli więzieni przez wiele lat). Analiza kryminalistyczna służy również do ustalenia ojcostwa i identyfikacji szczątków ludzkich ze miejsc katastrof.

Żródła:

Ten artykuł jest zmodyfikowaną wersją artykułu "The polymerase chain reaction," autor CK-12 Foundation (CC BY-NC 3.0).

Zmodyfikowany artykuł może być używany zgodnie z licencją CC BY-NC-SA 4.0.

Cytowane prace:

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). Forensic evidence and genetic profiles. (10th ed., pp. 430-431). San Francisco, CA: Pearson.

Bibliografia:

Kimball, J. W. (3 maja 2014). PCR. In Kimball's biology pages. Źródło: http://www.biology-pages.info/P/PCR.html.

OpenStax College, Biology. (23 marca 2016). Biotechnology. W OpenStax CNX. Źródło: http://cnx.org/contents/GFy_h8cu@10.8:exg4e4AU@7/Biotechnology.

Reece, J. B., Taylor, M. R., Simon, E. J., and Dickey, J. L. (2012). DNA profiling. In Campbell biology: Concepts & connections (7th ed., pp 242-246).

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). Amplifying DNA: The polymerase chain reaction (PCR) and its use in DNA cloning. (10th ed., pp. 414-416). San Francisco, CA: Pearson.

Wilkin, D. (23 marca 2016). Biotechnology and forensic science - advanced. W CK-12. Źródło: http://www.ck12.org/biology/Biotechnology-and-Forensic-Science/lesson/Biotechnology-and-Forensic-Science-Advanced-BIO-ADV/.