Enzymy restrykcyjne i ligaza DNA

Trawienie enzymami restrykcyjnymi. Lepkie końce i tępe końce. Reakcje ligacji. Tłumaczenie na język polski: fundacja Edukacja dla Przyszłości dzięki wsparciu Fundacji HASCO-LEK

Kluczowe punkty:

Enzymy restrykcyjne to enzymy tnące DNA. Każdy enzym rozpoznaje jedną lub kilka sekwencji docelowych i tnie DNA w miejscu tych sekwencji lub w ich pobliżu.
Niektóre enzymy restrykcyjne wykonują niesymetryczne cięcia, w wyniku czego powstają końce z jednoniciowymi odcinkami DNA (tzw. końce lepkie). Inne enzymy wytwarzają końce tępe.
Ligaza DNA jest enzymem łączącym DNA. Jeśli dwa fragmenty DNA mają pasujące końce, ligaza może je połączyć, tworząc pojedynczą, nieprzerwaną cząsteczkę DNA.
W klonowaniu DNA enzymy restrykcyjne i ligaza DNA są używane do wstawiania genów i innych fragmentów DNA do plazmidów.

Jak wyciąć i wkleić DNA?

W klonowaniu DNA, badacze produkują wiele kopii fragmentu DNA, na przykład genu. W wielu przypadkach klonowanie obejmuje wstawienie genu do fragmentu okrągłego DNA zwanego plazmidem, który może być powielony w bakteriach.

Jak można połączyć fragmenty DNA z różnych źródeł (takich jak ludzki gen i plazmid bakteryjny), aby utworzyć pojedynczą cząsteczkę DNA? Jedna popularna metoda oparta jest na enzymach restrykcyjnych i ligazie DNA.

Enzym restrykcyjny to enzym tnący DNA, który rozpoznaje określone miejsca w DNA. Wiele enzymów restrykcyjnych wykonuje niesymetryczne cięcia w miejscach rozpoznawania lub w ich pobliżu, wytwarzając końce z jednoniciowymi odcinkami.
Jeśli dwie cząsteczki DNA mają pasujące końce, można je połączyć za pomocą enzymu ligaza DNA. Ligaza DNA tworzy wiązania między cząsteczkami, tworząc pojedynczy fragment DNA.

Enzymy restrykcyjne i ligaza DNA są często stosowane do wstawiania genów i innych fragmentów DNA do plazmidów podczas klonowania DNA.

Enzymy restrykcyjne

Enzymy restrykcyjne znajdują się w bakteriach (i innych prokariotach). Rozpoznają i wiążą się do określonych sekwencji DNA, zwanych miejscami restrykcyjnymi. Każdy enzym restrykcyjny rozpoznaje tylko jedno lub kilka miejsc restrykcyjnych. Gdy znajdzie swoją sekwencję docelową, enzym restrykcyjny wykona dwuniciowe cięcie w cząsteczce DNA. Zazwyczaj cięcie znajduje się w samym miejscu restrykcyjnym lub w jego pobliżu i ma charakter uporządkowanego, przewidywalnego wzoru.

Jako przykład tego, jak enzym restrykcyjny rozpoznaje i tnie sekwencję DNA, rozważmy EcoRI, popularny enzym restrykcyjny stosowany w laboratoriach. EcoRI wykonuje cięcia w następującej miejscu:

Kiedy EcoRI rozpoznaje i tnie to miejsce, zawsze robi to w bardzo specyficzny sposób, w wyniku którego powstają końce z jednoniciowymi „nawisami” DNA:

Jeśli inny fragment DNA ma pasujące wystające odcinki DNA (na przykład, dlatego, że został również przecięty przez EcoRI), wystające fragmenty mogą się łączyć poprzez komplementarne parowanie zasad. Z tego powodu mówi się, że enzymy, które wytwarzają jednoniciowe końcówki, wytwarzają lepkie końce. Lepkie końce są pomocne w klonowaniu, ponieważ utrzymują razem dwa fragmenty DNA, dzięki czemu można je połączyć za pomocą ligazy DNA.

Nie wszystkie enzymy restrykcyjne wytwarzają lepkie końce. Niektóre są „tępymi nożami”, które przecinają środek sekwencji docelowej i nie pozostawiają wystających odcinków DNA. Enzym restrykcyjny SmaI jest takim przykładem:

Fragmenty o tępych końcach można łączyć ze sobą za pomocą ligazy DNA. Jednak fragmenty o tępych końcach są trudniejsze do ligacji (reakcja ligacji jest mniej wydajna i bardziej prawdopodobne jest, że się nie powiedzie), ponieważ nie ma jednoniciowych odcinków utrzymujących cząsteczki DNA w pozycji.

Enzymy restrykcyjne są nazwane od gatunków prokariotycznych, z których są izolowane. Na przykład enzymy izolowane z bakterii Escherichia coli zaczynałyby się od Eco (jak w EcoRI).

Ponad

3,

000

enzymów restrykcyjnych zostało wyizolowanych z różnych organizmów. Kilka przykładów pokazano w poniższej tabeli:

Nazwa	Źródło	Rozpoznawana sekwencja	Wzór cięcia
EcoRI	Escherichia coli	$\begin{aligned} 5^{'} - GAATTC - 3^{'} \\ 3^{'} - CTTAAG - 3^{'} \end{aligned}$ ‍	$\begin{aligned} 5^{'} - G ↓ AATTC - 3^{'} \\ 3^{'} - CTTAA ↑ G - 5^{'} \end{aligned}$ ‍
BamHI	Bacillus amyloliquefaciens	$\begin{aligned} 5^{'} - GGATCC - 3^{'} \\ 3^{'} - CCTAGG - 3^{'} \end{aligned}$ ‍	$\begin{aligned} 5^{'} - G ↓ GATCC - 3^{'} \\ 3^{'} - CCTAG ↑ G - 5^{'} \end{aligned}$ ‍
HindIII	Haemophilus influenzae	$\begin{aligned} 5^{'} - AAGCTT - 3 \\ 3^{'} - TTCGAA - 5^{'} \end{aligned}$ ‍	$\begin{aligned} 5^{'} - A ↓ AGCTT - 3 \\ 3^{'} - TTCGA ↑ A - 5^{'} \end{aligned}$ ‍
SmaI	Serratia marcescens	$\begin{aligned} 5^{'} - CCCGGG - 3 \\ 3^{'} - GGGCCC - 5^{'} \end{aligned}$ ‍	$\begin{aligned} 5^{'} - CCC ↓ GGG - 3 \\ 3^{'} - GGG ↑ CCC - 5^{'} \end{aligned}$ ‍
SacI	Streptomyces achromogenes	$\begin{aligned} 5^{'} - GAGCTC - 3 \\ 3^{'} - CTCGAG - 5^{'} \end{aligned}$ ‍	$\begin{aligned} 5^{'} - GAGCT ↓ C - 3 \\ 3^{'} - C ↑ TCGAG - 5^{'} \end{aligned}$ ‍

Tabela zmodyfikowana na podstawie "Common restriction endonucleases," autor CK-12 Foundation (CC BY-NC-SA 3.0).

Ligaza DNA

Jeśli czytałeś o replikacji DNA, być może już znasz ligazę DNA . W replikacji DNA zadaniem ligazy jest połączenie fragmentów nowo zsyntetyzowanego DNA w celu utworzenia jednolitej nici. Ligazy stosowane w klonowaniu DNA robią w zasadzie to samo. Jeśli dwa fragmenty DNA mają pasujące końce, ligaza DNA może połączyć je razem, tworząc nieprzerwaną cząsteczkę.

Jak działa ligaza DNA? Wykorzystując ATP jako źródło energii, ligaza katalizuje reakcję, w której grupa fosforanowa wystająca z końca 5' jednej nici DNA jest łączona z grupą hydroksylową wystającą z końca 3' drugiej nici DNA. Ta reakcja prowadzi do powstania tradycyjnego szkieletu cukrowo-fosforanowego.

Przykład: Tworzenie rekombinowanego plazmidu

Zobaczmy, jak można zastosować enzymy restrykcyjne i ligację do wstawiania genu do plazmidu. Załóżmy, że mamy gen docelowy, otoczony miejscami rozpoznawanymi przez EcoRI i plazmid zawierający jedno miejsce restrykcyjne EcoRI:

Naszym celem jest użycie enzymu EcoRI do wstawienia genu do plazmidu. Na początku, oddzielnie trawimy (wycinamy) fragment genu oraz przecinamy plazmid za pomocą EcoRI. W rezultacie otrzymujemy fragmenty z lepkimi końcami:

Następnie bierzemy fragment genu oraz liniowy (otwarty) plazmid i łączymy je wraz z ligazą DNA. Lepkie końce dwóch fragmentów łączą się ze sobą poprzez komplementarne parowanie zasad:

Po połączeniu przez ligazę, fragmenty stają się pojedynczym fragmentem nieprzerwanego DNA. Docelowy gen został wstawiony do plazmidu, w wyniku czego powstał rekombinowany plazmid.

Cięcie enzymami restrykcyjnymi oraz ligacja obejmuje wiele cząsteczek DNA

Na powyższym przykładzie widzieliśmy jeden wynik ligacji między genem a plazmidem przeciętym za pomocą EcoRI. Jednak podczas takiej ligacji mogą powstać także inne produkty. Na przykład, przecięty plazmid mógłby zamknąć się z powrotem bez pobierania genu. Podobnie, gen mógłby połączyć się z plazmidem, ale tyłem na przód (ponieważ jego dwa lepkie końce EcoRI są identyczne).

Cięcie enzymami restrykcyjnymi i ligacje, takie jak ta, przeprowadza się przy użyciu wielu kopii plazmidu DNA oraz genu. W rzeczywistości miliardy cząsteczek DNA są wykorzystywane w jednej ligacji! Wszystkie te cząsteczki zderzają się ze sobą i ligazą DNA, przypadkowo na różne sposoby. Tak więc, jeśli może powstać wiele różnych produktów, wszystkie będą powstawać z pewną częstotliwością - w tym te, których nie chcemy.

Jak możemy uniknąć „złych” plazmidów? Kiedy dokonujemy transformacji bakterii wykorzystując DNA z ligacji, każda z bakterii pobiera inny kawałek DNA. Po transformacji możemy sprawdzić bakterie i użyć tylko tych z prawidłowym plazmidem. W wielu przypadkach plazmid z transformowanych bakterii jest analizowany przy użyciu innego enzymu restrykcyjnego, aby sprawdzić, czy zawiera właściwą wstawkę we właściwej orientacji.

Szukaj wiadomości poza Khan Academy

Do you want to learn more about restriction enzymes? Check out this scrollable interactive and this simulation from LabXchange.

Do you want to learn more about DNA ligase? Check out this scrollable interactive and this simulation from LabXchange.

LabXchange to bezpłatna platforma edukacyjna online stworzona przez Wydziale Arts and Sciences uniwersytetu Harvarda i wspierana przez Fundację Amgen.

Żródła:

Ten artykuł jest zmodyfikowaną wersją artykułu "DNA cloning - Advanced," autor CK-12 Foundation (CC BY-NC 3.0).

Zmodyfikowany artykuł może być używany zgodnie z licencją CC BY-NC-SA 4.0.

Bibliografia:

Bergmann, D. (2011). Biotechnology. [Course handout] In BIO41: 2011 Molecular Biology lectures on DNA, RNA, and biotechnology.

Metzenberg, S. (2002). Lecture 5: Restriction endonucleases. In Recombinant DNA techniques. Źródło: http://escience.ws/b572/L5/L5.htm.

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). Bakterie i archeony. Campbell biology (edycja 10, strony 575-585). San Francisco, CA: Pearson.

Restriction site. (7 grudnia 2015). Dostęp 31 marca 2016 z Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_site.

Restriction endonucleases. (2016). W New England biolabs. Źródło: https://www.neb.com/products/restriction-endonucleases/restriction-endonucleases.

Chcesz dołączyć do dyskusji?

Zaloguj się

Sortuj według

Na razie brak głosów w dyskusji

Rozumiesz angielski? Kliknij tutaj, aby zobaczyć więcej dyskusji na angielskiej wersji strony Khan Academy.