Główna zawartość
Transformacja i typowanie szczepów bakteryjnych
Transformacja plazmidów bakteryjnych. Jak wygląda typowanie szczepów bakteryjnych. Produkcja i oczyszczanie białek. Tłumaczenie na język polski: fundacja Edukacja dla Przyszłości, dzięki wsparciu wolontariuszy.
Kluczowe punkty:
- Bakterie mogą pobierać obce DNA z otoczenia w procesie zwanym transformacją.
- Transformacja to kluczowy krok w klonowaniu DNA. Występuje po restrykcji i ligacji helisy DNA i przenosi pobrany materiał (najczęściej plazmidowy) do genomu bakterii.
- Po transformacji, bakterie są typowane na płytkach z dodatkiem antybiotyku. Bakterie posiadające odpowiednie geny na plazmidach będą antybiotykooporne i wyrosną na płytce w postaci kolonii.
- Z takich kolonii mogą powstawać kultury bakteryjne, które używana są przez ludzi do produkcji białek i plazmidów.
Proces klonowania DNA
Transformacja i typowanie są kluczowymi krokami w klonowaniu DNA. Klonowanie DNA to proces produkcji wielu kopii danego fragmentu DNA, na przykład określonego genu. Do tego procesu bardzo często wykorzystywane są bakterie.
Podczas eksperymentu, który badał przebieg typowego klonowania, naukowcy najpierw wprowadzili fragment DNA, taki jak gen, do kolistej cząsteczki DNA zwanej plazmidem. Podczas tego kroku użyto enzyów restrykcyjnych i ligazy DNA a cały proces nazwano ligacją.
Po ligacji, kolejnym krokiem jest włączenie fragmentu DNA do całego genomu w procesie zwany transformacją. Wtedy, możemy wykorzystać typowanie antybiotykowe i analizę materiału DNA , by identyfikować szczep bakteryjny w poszukiwaniu docelowego plazmidu.
Przebieg transformacji i typowania szczepów bakteryjnych krok po kroku
Poniżej przedstawiono typową procedurę transformacji i typowania szczepów bakteryjnych
- Do przygotowanego szczepu bakterii zostają dodane cząsteczki DNA (np. z ligacji).
- Bakterie poddawana są działaniu wysokiej temperatury, która powoduje, że niektóre z nich pobierają plazmid.
- Plazmidy używane w klonowaniu zawierają geny antybiotykooporności. W związku z tym, wszystkie bakterie zostają umieszczone na płytkach antybiotykowych by wytypować, które z nich przyjęły z otoczenia plazmidy.
- Bakterie bez plazmidu umierają. Każda bakteria posiadająca plazmid wzrasta w postaci kolonii.
- Kilka kolonii jest sprawdzanych by zidentyfikować jedną posiadającą docelowy plazmid (np. w procesie PCR lub restrykcji enzymatycznej).
- Kolonia posiadająca odpowiedni plazmid jest hodowana i używana do produkcji tych plazmidów lub białek.
Dlaczego musimy sprawdzać poszczególne kolonie?
Wszystkie szczepy, które wyrosły w postaci kolonii powinny zawierać plazmid (dzięki, któremu zyskują antybiotykooporność). Jednakże, zdarza się, że szczepy różnią się między sobą i nie posiadają identycznych plazmidów.
Jak to działa? Kiedy wycinamy i wklejamy fragment DNA, często powstają produkty uboczne, które wbudowują się w plazmid bakterii. Na przykład, gdy kiedy próbujemy wbudować gen do plazmidu i używamy przy tym określonych enzymów restrykcyjnych, może spowodować przedwczesne zamknięcie plazmidu (bez wbudowania genu), a w innych przypadkach może on zostać wbudowany w nieprawidłowy sposób.
Dlaczego ma to znaczenie, że gen ułoży się w plazmidzie nieprawidłowo - na przykład od tyłu? W niektórych przypadkach, nie ma to żadnego znaczenia. Jednak, jeżeli chcemy aby gen uległ ekspresji i wziął udział w biosyntezie białka, musi być on ułożony we właściwą stronę do promotora lub sekwencji kontrolnej, która przyśpieszy jego odczyt. W przypadku, gdyby gen ułożył się od tyłu nie dojdzie do ekspresji i biosyntezy docelowych białek.
Z powodu takich możliwości, bardzo ważnym jest aby zebrać DNA plazmidowe z każdej kolonii i sprawdzić czy jest prawidłowe. Enzymy restrykcyjne, PCR, i sekwencjonowanie DNA to powszechnie używane narzędzia do analizy materiału genetycznego.
Bakteryjna produkcja białek
Załóżmy, że zidentyfikowaliśmy kolonie z "dobrym" plazmidem. Co teraz? Jaki cel miało transformowanie, selekcja i analiza?
Scenariusz 1: Bakteria = fabryka plazmidów
W niektórych przypadkach, bakterie zostają "fabrykami plazmidów", produkującymi dużo plazmidowego DNA. Może ono zostać wykorzystane w dalszym procesie klonowania (np. by zbudować bardzie złożone plazmidy) lub w różnorodnych eksperymentach.
Poza tym, plazmidy mogą być używane bezpośrednio w celach praktycznych. Przykładem jest wykorzystanie plazmidów w transporcie ludzkich genów do tkanek płuc, co okazało się efektywne w leczeniu pacjentów z genetycznie odziedziczoną mukowiscydozą.
Scenariusz 2: Bakteria = fabryka białek
W innych przypadkach, bakteria może zostać wykorzystana do produkcji białek. Jeżeli plazmid ma prawidłową strukturę, bakteria wywoła ekspresję genów pod wpływem bodźca chemicznego. Ekspresja genu doprowadzi do produkcji mRNA, które zostanie wykorzystane do biosyntezy białka. Komórka bakterii po tym może przecięta (ulegać lizie) aby uwolnić białko do otoczenia.
Bakterie zawierają wiele białek i makrocząsteczek. Z uwagi na to, wyprodukowane przez nie białka muszą zostać oczyszczone (oddzielone od nadprogramowych cząstek) zanim zostaną użyte. Aktualnie istnieje wiele różnorodnych metod oczyszczania cząsteczki białka.
Jedną z nich jest chromatografia powinowactwa. Roztwór cząsteczek wyizolowanych z komórki bakteryjnej zostaje przelany przez kolumnę, wyposażoną w kilka warstw siateczki, które są pokryte przeciwciałami. W konsekwencji tego procesu, przeciwciała wiążą specyficzne cząsteczki.
Przeciwciała na sitkach są zaprojektowane tak, aby wiązać konkretne białka. W wyniku tego, te białka zostaną związane w trakcie przelewania przez kolumnę a reszta cząsteczek przez nią swobodnie przepłynie. Ostatecznym krokiem w chromatografii powinowactwa jest zebranie roztworu, który przepłyną przez kolumnę i użycie go w celach praktycznych.
Szukaj wiadomości poza Khan Academy
Do you want to learn more about bacterial transformation? Check out this simulation from LabXchange.
Do you want to learn more about the selection of transformed bacteria? Check out this simulation from LabXchange.
LabXchange to bezpłatna platforma edukacyjna online stworzona przez Wydziale Arts and Sciences uniwersytetu Harvarda i wspierana przez Fundację Amgen.
Chcesz dołączyć do dyskusji?
Na razie brak głosów w dyskusji