Główna zawartość
Elektroforeza żelowa
Technika wykorzystywana do rozdzielania fragmentów DNA i innych makrocząsteczek na podstawie ich wielkości i ładunku. Tłumaczenie na język polski: fundacja Edukacja dla Przyszłości dzięki wsparciu Fundacji HASCO-LEK
Kluczowe punkty:
- Elektroforeza żelowa jest techniką wykorzystywaną do rozdzielania fragmentów DNA w zależności od ich wielkości.
- Próbki DNA umieszcza się w studzienkach (nacięciach) na jednym końcu żelu, i stosuje się prąd elektryczny w celu wywołania migracji DNA przez żel.
- Fragmenty DNA są ujemnie naładowane, więc migrują w kierunku dodatniej elektrody. Ponieważ wszystkie fragmenty DNA mają taki sam stosunek ładunku na jednostkę masy, małe fragmenty przemieszczają się przez żel szybciej niż duże.
- Gdy żel jest wybarwiony barwnikiem wiążącym DNA, fragmenty DNA można zaobserwować jako prążki, każdy reprezentujący grupę fragmentów DNA o takich samych rozmiarach.
Wprowadzenie
Załóżmy, że właśnie wykonałeś reakcję PCR, otrzymując wiele kopii docelowego fragmentu DNA. A może wykonałeś klonowanie DNA, próbując „wkleić” gen do okrągłego plazmidu DNA .
Teraz chcesz sprawdzić, czy twój PCR zadziałał lub czy twój plazmid ma odpowiedni gen. Jakiej techniki możesz użyć do wizualizacji (bezpośredniej obserwacji) fragmentów DNA?
Elektroforeza żelowa
Elektroforeza żelowa to technika stosowana do rozdzielania fragmentów DNA (lub innych makrocząsteczek, takich jak RNA i białka) na podstawie ich wielkości i ładunku. Elektroforeza polega na przyłożeniu prądu do żelu zawierający interesujące cząsteczki. W zależności od ich wielkości i ładunku cząsteczki będą migrować przez żel w różnych kierunkach lub z różnymi prędkościami, umożliwiając ich rozdzielenie.
Wszystkie cząsteczki DNA mają taki sam stosunek ładunku na jednostkę masy. Z tego powodu elektroforeza żelowa fragmentów DNA rozdziela je wyłącznie na podstawie wielkości. Za pomocą elektroforezy możemy zobaczyć, ile różnych fragmentów DNA jest obecnych w próbce i jak duże są względem siebie. Możemy również określić bezwzględny rozmiar fragmentu DNA, porównując go do standardowego „odniesienia” złożonego z fragmentów DNA o znanych rozmiarach.
Czym jest żel?
Jak sama nazwa wskazuje, elektroforeza żelowa wymaga użycia żelu: kawałka materiału przypominającego galaretkę. Żele do rozdzielania DNA są często wytwarzane z polisacharydu zwanego agarozą , który występuje w postaci suchych, sproszkowanych płatków. Gdy agarozę ogrzeje się w buforze (woda z pewnymi solami) i pozostawi do ostygnięcia, powstanie stały, lekko kruchy żel. Na poziomie molekularnym żel jest macierzą cząsteczek agarozy, które są połączone wiązaniami wodorowymi i tworzą małe pory.
Na jednym końcu żel posiada wcięcia podobne do kieszeni, nazywane studzienkami, w których umieszcza się próbki DNA:
Przed dodaniem próbek DNA żel należy umieścić w aparacie. Jeden koniec aparatu jest podłączony do elektrody dodatniej, a drugi koniec do elektrody ujemnej. Główny korpus aparatu, w którym umieszczony jest żel, jest wypełniony roztworem buforowym zawierającym sól, który może przewodzić prąd. Chociaż możesz tego nie widzieć na powyższym obrazku (dzięki moim niesamowitym umiejętnościom artystycznym), bufor wypełnia aparat z żelem do poziomu, w którym ledwo zakrywa żel.
Koniec żelu ze studzienkami znajduje się przy elektrodzie ujemnej. Koniec bez dołków (do którego migrują fragmenty DNA) jest zlokalizowany przy elektrodzie dodatniej.
W jaki sposób fragmenty DNA migrują przez żel?
Gdy żel znajdzie się w aparacie, każda próbka DNA, którą chcemy zbadać (na przykład każda reakcja PCR lub każdy plazmid trawiony enzymami restrykcyjnymi) jest ostrożnie przenoszona do jednej ze studzienek. Jedna studzienka jest zarezerwowana dla drabinki DNA , standardowego markera, który zawiera fragmenty DNA o znanych długościach. Komercyjne drabinki DNA występują w różnych zakresach rozmiarów, dlatego powinniśmy wybrać taką z dobrym „pokryciem” zakresu rozmiarów naszych oczekiwanych fragmentów.
Następnie włącza się zasilanie aparatu i prąd zaczyna płynąć przez żel. Cząsteczki DNA mają ładunek ujemny, ponieważ posiadają grupy fosforanowe w szkielecie cukrowo-fosforanowym, więc zaczynają przemieszczać się przez żel w kierunku bieguna dodatniego. Kiedy zasilanie jest włączone, a prąd przepływa przez żel, mówi się, że żel biegnie.
W miarę upływu czasu krótsze fragmenty DNA będą przemieszczały się przez pory matrycy żelowej szybciej niż dłuższe. Po pewnym czasie najkrótsze fragmenty DNA będą blisko dodatniego końca żelu, a najdłuższe fragmenty DNA pozostaną w pobliżu studzienek. Bardzo krótkie fragmenty DNA mogą dojść do samego końca żelu, jeśli pozostawimy go zbyt długo (coś, za co zdecydowanie byłem winny!).
Wizualizacja fragmentów DNA
Po rozdzieleniu fragmentów DNA możemy przeanalizować żel i zobaczyć, jakie rozmiary prążków znajdują się na nim. Kiedy żel jest wybarwiany barwnikiem wiążącym DNA i umieszczany w świetle UV, fragmenty DNA świecą, umożliwiając nam zobaczenie DNA obecnego w różnych miejscach wzdłuż żelu.
Dobrze zdefiniowana „linia” DNA na żelu nazywa się prążkiem. Każdy prążek zawiera dużą liczbę fragmentów DNA o tej samej wielkości, które migrowały jako grupa do tej samej pozycji. Pojedynczy fragment DNA (lub nawet niewielka grupa fragmentów DNA) nie byłby widoczny na żelu.
Porównując prążki z próbki z drabinką DNA, możemy określić ich przybliżone rozmiary. Na przykład, jasne pasmo na żelu powyżej ma wielkość około
Sprawdź, czy rozumiesz
Na żelu powyżej są ponumerowane cztery pasy. (Pas jest korytarzem, przez który DNA migruje w miarę opuszczenia przez niego studzienki).
Który pas odpowiada każdemu z poniższych opisów?
Szukaj wiadomości poza Khan Academy
Do you want to learn more about gel electrophoresis? Check out this scrollable interactive and this simulation from LabXchange.
LabXchange to bezpłatna platforma edukacyjna online stworzona przez Wydziale Arts and Sciences uniwersytetu Harvarda i wspierana przez Fundację Amgen.
Chcesz dołączyć do dyskusji?
Na razie brak głosów w dyskusji